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蓝点马鲛头肾cDNA文库构建及鉴定doc

发布时间:2022-02-04

  蓝点马鲛头肾cDNA文库构建及鉴定 摘 要:研究运用SMART技术对蓝点马鲛头肾构建了cDNA文库,该文库原始文库滴度为2.26×106pfu/mL,文库容量为1.36×106pfu,符合文库构建的要求。从文库中随机挑选24个单克隆菌,以载体的通用引物进行菌落检测PCR,结果表明:重组率为95.8%,插入片段大小平均为1 000bp。该文库的构建满足了基因的分离与筛选,为进一步研究其相关基因克隆及分子生物学研究奠定基础。 关键词:蓝点马鲛;头肾;cDNA文库;构建 中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2015)17-36-03 Construction of cDNA Libraries and Identification of Head Kidney from Scomberomorus niphonius Wang Danni et al. (China filiang university,HangZhou 310018,China) Abstract:cDNA library of Scomberomorus niphonius head kidney was constracted by SMART technology.The original library titer is 2.26×106pfu/mL,and library capacity is 1.36×106pfu,meeting the requirements of library construction. RandomLy selected 24 monoclonal bacteria from the library,subjected to colony PCR detected by using universal primers. The results showed that recombination rate was 95.8%,an average insert size was 1 000bp. Construction of the library meet the isolation and screening of gene,and lay the foundation for further study of melecμlar biology and gene cloning. Key words:Scomberomorus niphonius;Head kidney;cDNA library;Construction 目前,分离基因最快、最有效的技术是cDNA文库的构建。cDNA文库是一种重组的克隆基因群,是以组织中的mRNA为模板,逆转录形成的互补DNA,并与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接转化而形成的,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库[1]。与其他文库相比,cDNA文库中获得的基因组是已经剪切将内含子去除的cDNA,因此可以在cDNA文库中便捷地获取基因序列的信息[2]。 蓝点马鲛(Scomberomorus niphonius)属于辐鳍亚纲、鲈形目,鲭亚目、鲭科、马鲛属,普遍分布于北太平洋的西边以及中国东海、黄海、渤海及南海(以海南文昌铺前附近海域最为著名)等地。该鱼体长而扁平,纺锤形,是北方海经济鱼类。在硬骨鱼的体内存在着头肾,位置在全肾的最前端,这个部位属于淋巴组织,具有免疫的功能,可以制造白血球以及消灭陈旧的红血球的功能。由于近年来人们对蓝点马鲛的肆意捕捞以及环境的不断恶劣,导致蓝点马鲛的产量急剧减少。本研究通过构建蓝点马鲛的cDNA文库,寻找一些具有特殊功能的基因,为其深入的研究奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 2014年5月在浙江省宁波市象山港捕捞蓝点马鲛样本12尾(平均重750±5g),取其头肾组织,并快速保存于液氮中,存于-80℃冰箱备用。 1.2 方法 1.2.1 提取总RNA 取蓝点马鲛的头肾组织,至于液氮中研磨,运用TRzol法提取总RNA,并取3μL进行琼脂糖凝胶电泳分析,以确定RNA的质量,并运用紫外分光光度计对RNA的纯度和浓度进行检测。 1.2.2 cDNA双链的合成 在一个200μL灭菌离心管中依次加入下列试剂,RNA(1μg),加DEPC水补足到3.25μL;5-Oligo(RT)(20μM)0.5μL;DMSO为0.5μL;然后72℃温浴3min,冰上冷却3min,短暂离心后,再依次加入下列试剂:5×First Srand Buffer 2μL,20Mm DTT(Clontech)1μL,dNTPs Mix 1μL,RNase inhibitor(40U\μL)0.25μL;SMART Scribe RTase(Clontrch)1μL;反应条件42℃温浴1h,70℃15min,冷却到室温.然后进行第二链合成。在第二链合成离心管中依次加入First Strand cDNA 2μL,去离子水80μL,10×Advantage 2 PCR Buffer 10μL,50xdNTPs Mix 2μL,5’PCR引物,3’PCR引物2μL,及50×Advantage 2 Polymerase Mix 2μL,混匀,反应条件:94℃、2min;98℃、10s,60℃、30s,68℃、3min,25个循环。反应完成后,取5μL用于琼脂糖凝胶电泳检测。其余放于-20℃保存备用。 1.2.3 cDNA与质粒载体的连接及转化 产物与pUCm-T载体用T4连接酶连接,反应体系如下:PCR产物1μL,pUCm-T载体1μL,2×快连buffer2.5μL,T4 DNA Ligase 0.5μL;反应条件:22℃、8min。将连接产物转入DH5α中,冰上放置30min,热击90s,然后再放回冰上3min,添加 600μLSOC无抗液体培养基,37℃,200振荡复苏培养1h,获得了蓝点马鲛头肾初始cDNA文库。 1.2.4 cDNA文库的容量测定 从文库中取出10μL菌液,用SOC培养基分别稀释10、100、1 000、10 000倍,然后再分别吸取100μL涂板,37℃丰培养16h。计算平板的总克隆数,公式如下:文库滴度=平板上的克隆数×稀释倍数/涂板体积)[3],文库容量=库包装体积×滴度[4]。分别计算出cDNA文库滴度和库容量。 1.2.5 cDNA文库的质量鉴定 cDNA文库的质量鉴定主要有2种方法:一是检测文库的重组率,二是对插入片段的检测。通过应用蓝白斑筛选来鉴定文库的重组率,计算公式为:重组率(%)=白斑数/(白斑数+蓝斑数)×100[5]。对其插入片段的检测,随机挑取单克隆菌,进行菌液检测PCR,PCR反应条件为预变性94℃、5min;94℃、1min,55℃、30s,72℃、2min,35个循环;72℃延伸5min。反应结束后,进行琼脂糖电泳的检测,然后筛选阳性菌送测序。 1.2.6 序列分析 利用NCBI中的VecScreen程序识别所测序列并去除载体,利用DNAStar软件SeqMan程序比对序列,将得到在GenBank上进行BLAST比对分析后的生物EST序列。 2 结果与分析 2.1 提取总RNA和分离mRNA 总RNA的提取纯度要高,完整性较好,这是构建cDNA文库的基础。本研究选用试剂盒从蓝点马鲛头肾中获得RNA,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明(见图1):18s和28s的条带都比较完整和清晰,28s条带的浓度是18s的2倍,且未发现拖尾现象,说明所提取的RNA完整性好,质量较高。经紫外分光光度计检测后,RNA浓度为均在295~325ng/μL,而且OD260/OD280均在1.8~2.0,表明RNA的纯度较高,并且达到了反转录所需的RNA浓度,可以用于cDNA文库的构建。 图1 蓝点马鲛总RNA电泳 2.2 cDNA文库滴度的测定 cDNA文库主要是通过文库滴度和文库容量来检测的。通过公式计算之后,原始文库滴度为2.26×106pfu/mL,文库容量为1.36×106pfu,而SMART文库构建要求未扩增文库的滴度大于1×106pfu/mL,所以符合建库的要求。 2.3 cDNA文库插入片段的测定 从文库中随机挑取24个单克隆菌,每个菌落加600μL含Amp抗生素的SOC液体培养基,用载体的通用引物进行菌落检测PCR。检测结果(图2)表明,挑选的这24个菌中,有23个出现了清晰条带,条带主要集中在1~2kb。根据公式可计算出该蓝点马鲛的头肾cDNA文库的重组率为95.8%,而且所构建的cDNA文库中cDNA的插入片段分布均匀,呈现出大小不一的扩增片段。可见,本实验成功的构建了蓝点马鲛头肾的cDNA文库,为后续筛选一些有功能的蛋白奠定了良好的基础。 图2 菌落检测PCR电泳 2.4 测序及EST分析 从cDNA原始文库中挑取50个单克隆菌进行测序,利用NCBI中的VecScreen程序对所测序列进行分析,并去掉载体、短序列及一些相对分子量较低的序列后,共获得了46个有效序列,将获得的EST序列利用NCBI的BlastX进行相似性比对分析,选择一些具有代表性的序列进行分析(见表1)。 表1 蓝点马鲛cDNA文库部分EST [克隆编号\&长度(bp)\&相似度(%)\&相似基因来源的物种名\&推定蛋白种类\&推定蛋白功能\&S3\&981\&90\&奈里朴丽鱼\&泛素连接酶\&是蛋白质降解的信号\&S4\&983\&86\&深裂眶锯雀鲷\&甲基转移酶\&能引起氨基酸转移\&S8\&1073\&90\&斑马宫丽鱼\&真核翻译起始因子\&参与线\&斑马宫丽鱼\&钙网蛋白\&调节细胞内钙离子\&S13\&1028\&86\&大黄鱼\&CSRP2蛋白\&促进细胞进入有丝分裂\&S16\&936\&83\&尼罗非鱼\&锌指蛋白\&调控基因转录\&S27\&1060\&90\&大黄鱼\&肽链释放因子\&调控细胞周期,组建细胞骨架\&S29\&980\&96\&安大略鲑\&促分裂素活化蛋白\&促进细胞分裂\&S36\&1028\&91\&尼罗非鱼\&SH3结构域蛋白\&介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子结合\&S37\&982\&90\&红旗东方?鱼\&丝/苏氨酸蛋白激酶\&刺激胞外基质合成\&S39\&1013\&88\&慈鲷类\&输入蛋白\&帮助核蛋白进入细胞核\&S48\&956\&89\&布氏新亮丽鲷\&KLF转录因子\&参与细胞增殖、凋亡和分化\&S54\&923\&87\&大黄鱼\&PDZ结构域\&调控蛋白质之间相互作用\&S74\&952\&90\&尼罗非鱼\&BTG1蛋白\&参与细胞代谢\&] 3 讨论与结论 cDNA文库的构建是一种基础工具,可以研究基因的功能和发现新基因,因而被广泛运用于生物学研究领域中。目前通过cDNA文库筛选已经发现了许多基因[6],而以蓝点马鲛为原材料构建cDNA文库尚未报道。本研究通过提取RNA,采用In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit技术,构建蓝点马鲛头肾cDNA文库,并通过对其容量、质量的检测,从而判断该文库的参考价值的。 本实验所构建的原始cDNA文库的滴度为 2.26×106pfu/mL,而构建文库一般要求其滴度≥1×106pfu/mL,与目前已经构建的cDNA文库比较,例如张少会等[7]构建的草莓果实cDNA文库原始滴度为1.13×106pfu/mL;韦春梅等[8]构建松墨天牛幼虫的cDNA文库原始滴度为5.45×106pfu/mL;陈美元[9]构建了双孢蘑菇As2796全长cDNA文库的原始滴度为3.3×106pfu/mL,经过查阅文献及比较,表明本研究所构建的文库是可以满足之后实验的需要。此外,对其插入片段进行检测,其片段长度平均为1 000bp。 高质量的RNA是活的cDNA的基础,RNA的纯度和完整性决定着cDNA文库信息的完整性[10-11]。本实验为了提高RNA的质量,不经过mRNA的纯化过程,直接用总RNA来建库,减少了mRNA的降解和丢失,可以使mRNA最大限度的转录为cDNA。此外,在LD-PCR中,设置25个循环,合成了足量的cDNA,使文库的表达序列变得富集。 参考文献 [1]萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].第3版.北京:科学出版社,2002. [2]CARNINCI P,SHIBATA Y,HAYATSU N,et al.Normalization and subtraction of cap-trapper-selected cDNAs to prepare full-length cDNA libraries for rapid discovery of new genes[J].Genome Res,2000,10(10):1617-1630. [3]王楠,周莹,姚丹,等.春大豆花芽cDNA文库的构建及质量分析[J].华南农业大学学报,2014,35(1):73-78. [4]蒋晶,肖熙鸥,曹必好,等.茄子青枯病诱导的cDNA文库构建与鉴定[J].江苏农业科学,2014,42(4):22-24. [5]张雨良,张树珍,王健华,等.感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价[J].热带作物学报,2012,33(6):1096-1100. [6]范睿,凌鹏,顾文亮,等.海南?XcDNA文库的构建及评价[J].热带作物学报,2013,34(4):36-640. [7]张少会,沈元月.草莓果实cDNA文库的构建及鉴定[J].北京农业学院学报,2014,29(2):12-14. [8]韦春梅,罗淋淋,吴华俊,等.松墨天牛幼虫cDNA文库的构建及EST分析[J].基因组学与应用生物学,2014,33(1):113-120. [9]陈美元.双孢蘑菇As2796全长cDNA文库的构建及鉴定[J].福建农业学报,2012,27(11):1201-1204. [10]黄功华,梁景耀.酵母细胞中构建HL-60细胞的酵母双杂交cDNA文库[J].广东医学院学报,2004,22(1):1-3. [11]汤华,郑用琏.玉米耐铝毒基因的分离[J].植物生理与分子生物学学报,2005,31(5):507-514. (责编:张宏民)

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